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產(chǎn)品說明
T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 連接酶，該酶可以催化粘性末端或者平末端雙鏈 DNA 或 RNA 的 5’-P 末端和 3’-OH 末端之間形成磷酸二酯鍵，同時(shí) T4 DNA 連接酶可以修補(bǔ)雙鏈 DNA、雙鏈 RNA 或DNA/RNA 復(fù)合物上的單鏈缺口(single-strand nicks)，但對(duì)于單鏈核酸無活性。T4 DNA Ligase 進(jìn)行酶連反應(yīng)時(shí)需要 ATP 作為輔助因子。
本公司T4 DNA連接酶是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白
活性定義
在 20 μl 1×T4 DNA 連接酶反應(yīng)緩沖液中，16℃ 反應(yīng)條件下，30 分鐘使 50% 的經(jīng) HindIII 消化的 λ DNA 片段 [5′ 端濃度為 0.12 μM（300μg/ml），DNA 總量 6μg] 連接所需的酶量，為 1 個(gè)單位。
活性測(cè)定條件
50 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25℃) ，1 mM ATP，10 mM MgCl2，10 mM DTT，16℃ 溫育，推薦DNA 5′末端濃度為 0.1-1.0 uM。
濃度：400U/μl
保存條件：-20℃
特點(diǎn)
? 完成粘性末端連接反應(yīng)僅需 1 分鐘；
? 熱失活：65℃ 加熱10min。
適用范圍
? 限制性內(nèi)切酶克隆
? 高效連接粘性末端和平末端
? T/A 克隆
? 構(gòu)建高豐度克隆文庫(kù)
? RNA 和 DNA 的連接
? 雙鏈DNA、RNA 或 DNA/RNA的單鏈切刻修復(fù)等
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE1301A | AE1301B |
T4 DNAligase | 10kU | 50kU |
10×T4 DNA Ligase Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
質(zhì)量控制
相關(guān)測(cè)試表明無外源內(nèi)切、外切脫氧核糖核酸酶、RNase污染和磷酸酯酶，滿足常規(guī)連接反應(yīng)要求。PCR方法檢測(cè)無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
相關(guān)產(chǎn)品
感受態(tài)細(xì)胞
應(yīng)用實(shí)例
1. 限制性內(nèi)切酶酶連克隆
1）按下表配制反應(yīng)體系
反應(yīng)組分 | 體積/ul |
10× Buffer | 2 |
載體 | 50ng |
基因片段 | 50ng-150ng |
T4 DNAligase (400U/μl) | 1-2 |
H2O | Variable |
總體積 | 20 |
2) 如為粘末端連接反應(yīng)，22°C連接5-60min，或4°C連接過夜；
3）連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化（或凍存于-20°C）。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實(shí)驗(yàn)使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項(xiàng)
l 推薦 DNA 5′ 末端濃度為 0.1-1.0 μM，16-22℃ 溫育。
l 添加 5-10% PEG4000 或 PEG6000 能夠提高平末端 DNA 的連接效率。
l 5×Ligase Buffer 含有 ATP，使用前應(yīng)在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然后置于冰上。不要加熱融化和不宜反復(fù)凍融以免 ATP 降解。
l T4 DNA Ligase 對(duì)熱敏感，容易失活。熱失活條件：65℃條件下加熱 10 min，或者 70℃條件下作用 5 min 。
l 對(duì)于普通的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作，不必對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化。但用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，建議先用 DNA 純化試劑盒純化 DNA，然后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
l 如果需要對(duì)于連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察，可以在上樣前對(duì)酶進(jìn)行熱失活，以免結(jié)合有 T4 DNA Ligase 的 DNA 可能會(huì)在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)帶移或彌散現(xiàn)象。
