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產品說明
Ec DNA 連接酶來源于大腸桿菌，分子量為 77kDa，催化雙鏈 DNA 中 5’-磷基和 3’-羥基之間形成磷酸二酯鍵的 DNA 連接酶。作用與 T4 DNA Ligase 相同，但以 NAD+為輔酶。最適反應 pH 為7.5-8.0 (Tris-HCl buffer)。與 T4 DNA Ligase 可連接粘性末端和平末端相比，本酶只能催化粘性末端 DNA 之間的連接，但如果在 PEG 及高濃度一價陽離子存在的條件下，也能連接平滑末端的 DNA。與 T4 DNA Ligase 能將DNA 的 5′-P 末端與 RNA 的 3′-OH 以及 RNA 的 5′-P 末端與DNA 的 3′-OH 連接不同，本酶不能催化DNA 與 RNA 以及 RNA 之間的連接。對單鏈 DNA 或 RNA 和平末端 DNA 不具有活性。由于當寡核苷酸與互補的靶 DNA 不完全配對時，也會發生一定比例的連接反應，因此不推薦用于 SNPs 的精準檢測。
本公司Ec DNA ligase是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1 單位指在溫度為16℃，20ul的1× Ec DNA ligase Buffer緩沖體系的反應條件下，30 min內能連接50%被HindIII消化的6ug λ DNA片段 [5′端濃度為0.12 μM（300 μg/ml）]所的酶量。
活性測定條件
30 mM Tris-HCl（pH 8.0 @ 25℃），4 mM MgCl2，1 mM DTT，26 uM NAD+，50 μg/mL BSA，反應溫度16℃。
濃度：10U/μl
保存條件：-20℃
特點
? 優先連接dsDNA中的缺口，而非顯著連接兩個dsDNA片段；
? 熱失活：65℃加熱20min。
適用范圍
? dsDNA切刻修復；
? Okayama 和 Berg cDNA 克隆 。
產品包裝規格及組成
Component | AE1311A | AE1311B |
Ec DNA ligase | 2000U | 10000U |
10× Ec DNA ligase Buffer | 0.5ml | 1.0ml×2 |
質量控制
相關測試表明無外源內切、外切脫氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，200 μg/ml BSA，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
相關產品
AE1301: T4 DNA ligase
應用實例
1. DNA連接反應
1）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積/ul |
10× Buffer | 2 |
粘性末端DNA | 100ng-1μg |
Ec DNA ligase (10U/μl) | 1-2 |
H2O | Variable |
總體積 | 20 |
2) 16°C連接15min
3）對于較長的雙鏈DNA底物，瓊脂糖電泳檢測連接產物；對于短于100bp的短片段DNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測連接產物。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 本產品需要輔助因子NAD+參與反應
l 本產品不適合平末端片段連接，如需連接平末端片段，請使用T4 DNA ligase（AE1301）
l Buffer中的BSA 在-20℃下易產生沉淀，應盡量避免多次反復凍融。短期使用請在 4℃下保存。產生稍許沉淀不影響反應效果。
