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ssDNA/RNA 環(huán)化連接酶為熱穩(wěn)定的DNA/RNA連接酶，不依賴于ATP，可催化單鏈DNA或單鏈RNA的環(huán)化，也可催化其分子間連接，但其對單鏈DNA的連接效率更高。環(huán)化反應(yīng)中，要求催化底物單鏈DNA/RNA具有5’-磷酸基團(tuán)和3’-OH基團(tuán)。對于大于15nt的單鏈底物，該酶都能高效的連接。該酶還可催化DNA或RNA分子與預(yù)腺苷化的DNA接頭之間的連接，另外，在ATP過量的情況下，該酶可使DNA/RNA分子腺苷化。
本公司ssDNA/RNA環(huán)化連接酶是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1個活性單位為60°C下1小時內(nèi)催化1pmol 5’-磷酸化Oligo (55mer)完全環(huán)化所需的酶量。
活性測定條件
30mM Tris-acetate (pH 7.5), 60mM potassium acetate, 1mM DTT，65℃溫育。
濃度：100U/ul
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融
特點與應(yīng)用
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE1358A | AE1358B |
ssDNA/RNA環(huán)化連接酶 | 2kU | 10kU |
10×環(huán)化酶Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
50 mM MnCl2 | 0.2ml | 1.0ml |
質(zhì)量控制
經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控檢測，無單鏈DNA核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、RNase和磷酸酶污染。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1 mM DTT and 0.1 mM EDTA, 50% glycerol.
使用實例：
反應(yīng)組分 | 體積或濃度 |
10×CircLigase Buffer | 2ul |
50 mM MnCl2 | 1ul |
5’磷酸化 ssDNA/RNA | 10-100 pmol |
CircLigase (100 U/μl) | 1-2ul |
H2O | Xul |
總體積 | 20ul |
2）65℃×60min反應(yīng)，
3）加入1 μl Proteinase K, 37°C溫育15min，或85°C加熱10min失活酶，或加入10mM EDTA終止反應(yīng)。Proteinase K 有助于釋放被連接酶結(jié)合的RNA。
4）尿素變性PAGE電泳檢測連接產(chǎn)物，或按實驗?zāi)康倪M(jìn)行后續(xù)操作。
經(jīng)典環(huán)化結(jié)果（50nt ssDNA）如下
泳道1為未加環(huán)化酶，2為加入環(huán)化酶，3為環(huán)化產(chǎn)物加入ExoI酶消化產(chǎn)物。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項
l 添加終濃度20-50μM的ATP可提高環(huán)化效率（ATP終濃度高于 20μM 以上時會極大抑制環(huán)化效率，甚至導(dǎo)致環(huán)化失敗），高于1mM ATP濃度會抑制連接反應(yīng)。
l 對于單鏈DNA產(chǎn)物的連接，需要加入終濃度2.5mM MnCl2。
l 5’端未磷酸化的底物不能用于連接，3’端無-OH的底物不能用于連接。即環(huán)化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團(tuán)，3’端含有 OH。
l 對于含有二級或復(fù)雜結(jié)構(gòu)的連接底物，可加入0.4~0.8 M Betain以提高連接效率。不過本公司結(jié)果表明Betain沒有提升連接效率。
l 該酶對底物堿基具有選擇性，5’末端連接效率: G > A >>> T (U)>>> C，3’末端連接效率T(U) > A > G，當(dāng)3’端的堿基為C時不能用于連接，幾乎無連接產(chǎn)物。
l 本酶對 ssDNA 和 RNA 的環(huán)化效率極高，多數(shù)情況下， 90%以上的底物被環(huán)化。未被環(huán)化的 ssDNA 可通過加入 5U 本公司Exonuclease I（AE2202），37°C 消化 15min 去除，以獲得高純度的環(huán)化 ssDNA。未環(huán)化的 ssRNA，可利用本公司的RNase R去除。
l 對于連接底物量較少的實驗來講，推薦縮小體系，而不是減少酶的用量。在小體系實驗時注意體系的蒸發(fā)，可加入礦物油以防止蒸發(fā)。
