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T4 RNA連接酶 2，也被稱為 T4 Rnl2（gp24.1），同時具有 RNA 鏈分子間和分子內連接活性。與 T4 RNA 連接酶 1（NEB #M0204）不同的是， T4 RNA 連接酶 2 對雙鏈 RNA 切刻的連接活性要明顯高于對單鏈 RNA 的末端連接。該酶也可用于連接雙鏈結構中 RNA 3′ 羥基和 DNA 5′ 磷酸基的切刻。
本公司T4 RNA 連接酶 2，截短型是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1 單位指 20 μl 反應體系中， 37℃ 條件下， 30 分鐘完全連接 0.4 μg 的 23-mer 和 17-mer RNA等摩爾混合物所需的酶量。
活性測定條件
1× T4 RNA 連接酶 2 反應緩沖液[50 mM Tris-HCl (pH 7.5 @ 25℃)，2mM MgCl2，1 mM DTT，400 μM ATP]， 0.4 μg 的 23-mer 和 17-mer RNA等摩爾混合物，37℃ 溫育。
濃度：10U/μl
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復凍融
特點與適用范圍
? 連接粘性末端接頭
? DNA或RNA序列連接到任何RNA 3′末端
? 用于 DNA/RNA 雜交鏈中，RNA 3′ 羥基與 DNA 5′ 磷酸基的連接
? 連接雙鏈 RNA 中切刻
產品包裝規格及組成
Component | AE1353A | AE1353B |
T4 RNA連接酶2 | 150U | 750U |
10× T4 RNA連接酶Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
50% PEG8000 | 0.2ml | 1.0ml |
質量控制
相關測試表明無外源單鏈和雙鏈 DNA 核酸內切酶、外切酶、 RNase 以及磷酸酶的污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，35mM (NH4)2SO4, 0.1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，pH 7.5 @ 25°C
使用實例：3′ OH of RNA和5′磷酸化DNA linker連接反應
1）制備DNA/RNA切刻型底物：將等摩爾比例的DNA/RNA混合物在65度加熱3min，在冰上放置2min。制備DNA/RNA切刻型底物可以立即使用，也可以保存在-20度備用。
2）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積或濃度 |
10×T4 RNA連接酶Buffer | 2ul |
MgCl2 (100mM) | 1.6 μl |
Nicked DNA/RNA Substrate (10 μM) | 2ul |
50% PEG8000* | 4ul |
T4 RNA Ligase 2 (10 U/μl) | 1ul |
無核酸酶H2O | 9.4ul |
總體積 | 20ul |
3）25℃×1h反應，
3）添加蛋白酶K或終濃度20mM EDTA失活酶，
4）尿素變性PAGE電泳檢測酶切產物，或按實驗目的進行后續操作。
* 為了提高連接效率，PEG8000 濃度可以高達25%
使用實例：dsRNA中切刻的連接
1）制備dsRNA切刻型底物：將等摩爾比例的dsRNA混合物在65度加熱3min，在冰上放置2min。制備dsRNA切刻型底物可以立即使用，也可以保存在-20度備用。
2）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積或濃度 |
10×T4 RNA連接酶Buffer | 2ul |
Nicked dsRNA Substrate (10 μM) | 2ul |
T4 RNA Ligase 2 (10 U/μl) | 1ul |
無核酸酶H2O | 15ul |
總體積 | 20ul |
3）25℃×1h反應，
3）添加蛋白酶K或終濃度20mM EDTA失活酶，
5）尿素變性PAGE電泳檢測酶切產物，或按實驗目的進行后續操作。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 熱失活：80℃溫育20分鐘。
l 可加入核酸酶抑制劑防止RNA污染。
