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5’ DNA 腺苷化試劑盒能將 5’-磷酸化的DNA 寡核苷酸 5’端腺苷化。試劑盒操作簡便，反應(yīng)組分包括Mth RNA ligase、ATP 和10反應(yīng)buffer，可以高效的將5’-磷酸化的單鏈 DNA腺苷化，生成5’-腺苷化DNA（AppDNA）。該試劑盒通常能將 95%的5’-磷酸化DNA 轉(zhuǎn)化成腺苷化 DNA，高效的轉(zhuǎn)化不僅增加產(chǎn)量，還能避免膠回收提純步驟。使用該試劑盒對 5’-磷酸化ssDNA 進(jìn)行腺苷化處理時，不需要對 3’端進(jìn)行保護(hù)。
本試劑盒中的Mth RNA ligase是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白，分子量45.3kDa。
活性測定條件
在1X 5′ DNA Adenylation Buffer（50?mM sodium acetate, pH 6.0, 10?mM MgCl2, 5?mM DTT, 0.1?mM EDTA），100?μM ATP下, 65度溫育1小時。
濃度：50pmol/μl（2.265mg/ml）
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融
特點與適用范圍
? 單步反應(yīng)，即可腺苷化
? 最簡便的腺苷化方法
? 腺苷化產(chǎn)物無需純化
? 65度反應(yīng)消除了底物二級結(jié)構(gòu)的抑制作用
? 對 ssDNA 連接頭腺苷化后，用于與3’-OH RNA連接建庫進(jìn)行二代測序
? 反應(yīng)體系易于放大，放大6倍對效率沒有影響，甚至可以放大到umole級別
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE1356A | AE1356B |
Mth RNA ligase | 10次（20ul） | 50次（100ul） |
10×5’AppDNA/RNA Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
1mM ATP | 0.2ml | 1.0ml |
質(zhì)量控制
經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控檢測，無單鏈和雙鏈 DNA核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、RNase、磷酸化酶、內(nèi)源DNA污染。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
應(yīng)用舉例：
1、ssDNA的5’腺苷化
1) 按如下方案配制反應(yīng)混合液：
Components | Volume |
5’-Phosphorylated DNA Oligonucleotide | 100 pmol (5 pmol/μl) |
10×5’AppDNA/RNA Buffer | 2 μl |
1 mM ATP | 2 μl |
Mth RNA Ligase(50 μM) | 2 μl (100 pmol) |
Nuclease-free Water | to 20 μl |
2) 65°C溫育2小時
3) 85度加熱5分鐘，失活酶
備注：大量制備5’腺苷化ssDNA時，可以按如下方案操作（20-50ul）：30?μM ssDNA，30?μM Mth RNA Ligase，65°C反應(yīng)2?h。1 μl蛋白酶K× 37°C×15min失活連接酶，酚氯仿異戊醇(25:24:1)、氯仿異戊醇(49:1)抽提，乙醇沉淀5’腺苷化ssDNA。
2、ssDNA的5’腺苷化與3’-OH RNA樣本連接
1) 按如下方案配制反應(yīng)混合液：
Components | Volume |
10XAM Buffer A | 2 μl |
50% PEG 8000 | 8 μl |
5’-OH/3’-OH RNA Substrate (10 μM) | 1 μl |
5′P-DNA linker (20 μM) | 2 μl |
ATP (1 mM) | 2 μl |
Thermostable 5′App DNA/RNA Ligase (20 μM) | 1 μl |
Mth RNA Ligase (50 μM) | 0.5 μl |
Nuclease-free H2O | to 20 μl |
2) 65°C溫育2小時
3) 加入1 μl Proteinase K, 37°C溫育15min，或加入終濃度10mM EDTA終止反應(yīng)。Proteinase K 有助于釋放被連接酶結(jié)合的RNA。
注: 本公司有售Thermostable 5’ App DNA/RNA Ligase（AE1357）。
注意事項
l 該酶轉(zhuǎn)化率低，需要約等摩爾濃度的酶和底物 DNA 進(jìn)行反應(yīng)。
l 在二代測序 cDNA文庫構(gòu)建實驗中，預(yù)腺苷化 DNA 的連接頭可用于 RNA 3′ 末端的連接。
l 若需要回收腺苷化的單鏈核酸并去除蛋白和ATP，可以采用酚氯仿抽提、柱純化等
l ssDNA的3’-端可以采用磷酸化、NH2等修飾，從而減少ssDNA環(huán)化產(chǎn)物。
l 對于3’-端沒有保護(hù)的ssDNA底物，建議把ATP濃度提高到0.5mM，從而抑制ssDNA環(huán)化與寡聚化
