咨詢熱線：
400-660-9586
T4 RNA連接酶2，截短型KQ（T4 Rnl2tr KQ）能特異性將5′末端預腺苷化的DNA或RNA連接到RNA的3′OH末端。反應無需ATP，但需預腺苷化接頭。
T4 Rnl2tr KQ是T4 RNA連接酶2，截短型的雙點突變體。 K227的突變降低了賴氨酰腺苷化。由于降低了T4 Rnl2tr從接頭將腺苷基團轉移到RNA 5′磷酸基的活性，K227Q可以減少T4 Rnl2tr 非特異性的連接（串聯體和環）。在T4 Rnl2tr K227Q中進一步突變R55K，提高了酶的連接活性，使其與野生型T4 Rnl2tr連接活性水平一致。
因為不再使用ATP，而改用預腺苷化接頭，同時降低賴氨酰腺苷化酶的活性，所以連接反應的背景可以降至最低。該酶已用于二代測序 Small RNA的文庫構建中，優化了接頭的連接過程。
本公司T4 RNA 連接酶2，截短型KQ是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
200活性單位指在25℃，1×T4 RNA連接酶反應緩沖體系（20ul），60 min內將80%的31-mer RNA（5′-FAM-rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUrCrArGrCrArArUrA-3′ ）連接到預腺苷化的miRNA通用克隆接頭17-mer DNA（5′-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3′，14μM）末端所需的酶量。
活性測定條件
1× T4 RNA連接酶2反應緩沖液：50 mM Tris-HCl (pH7.5 @ 25℃)，10 mM MgCl2，1 mM DTT，10% (w/v) PEG 8000, 20 pmol of 5′-FAM-RNA, 40 pmol 預腺苷化DNA，25℃溫育60min。
濃度：200U/μl
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復凍融
特點與適用范圍
? 將預腺苷化的DNA或RNA序列標簽連接到任何RNA 3′末端
? 將單鏈腺苷化引物連接至小RNA上，用于cDNA文庫構建
? 將單鏈腺苷化引物連接至RNA上，用于鏈特異cDNA文庫構建
產品包裝規格及組成
Component | AE1355A | AE1355B |
T4 RNA連接酶2，截短型KQ | 2000U | 10kU |
10× T4 RNA連接酶2 Buffer | 0.2ml | 1.0ml |
50% PEG8000 | 0.2ml | 1.0ml |
質量控制
相關測試表明無外源單鏈和雙鏈 DNA 核酸內切酶、外切酶、 RNase 以及磷酸酶的污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol，pH 7.5 @ 25°C
使用實例：3′ OH of RNA和5′預腺苷化DNA linker連接反應
1）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積或濃度 |
10×T4 RNA連接酶2 Buffer | 2ul |
RNA底物（10μM） | 2ul |
5′預腺苷化DNA linker（20μM） | 2ul |
50% PEG8000* | 4ul |
酶(200 U/μl) | 1-2ul |
無核酸酶H2O | Yul |
總體積 | 20ul |
2）25℃×1-2h反應，
3）添加蛋白酶K或終濃度20mM EDTA失活酶，
4）尿素變性PAGE電泳檢測酶切產物，或按實驗目的進行后續操作。
* 為了提高連接效率，PEG8000 濃度可以高達25%
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 熱失活：65℃溫育20分鐘。
l 可加入核酸酶抑制劑防止RNA污染。
