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產品說明
T4多聚核苷酸激酶能夠催化ATP的γ-位磷酸基團轉移到寡核苷酸鏈（雙鏈或單鏈DNA或 RNA）的5′ -羥基末端以及3′ -單磷酸核苷上。本酶為修飾后的T4PNK，具有所有激酶的活性，但是缺失了3′磷酸酶活性。 尤其適用于將3′ 已經磷酸化的單核苷酸5′磷酸化，制備pNp底物；以及3′端有磷酸基團的寡核苷酸的5′端進行磷酸化標記。 未改造的野生型T4多聚核苷酸激酶（AE1001）還具有3′磷酸酶活性，將3′ -磷酸基團從寡核苷酸的3′磷酸末端、脫氧3′-單磷酸核苷和脫氧3′ -二磷酸核苷上水解掉。
本公司T4 PNK(3′磷酸酶活性缺失) 是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1活性單位指在37℃下，1× T4 PNK反應緩沖體系下，30 min內將1 nmol ATP上的磷酸基團摻入酸不溶性物質所需的酶量。
活性測定條件
1× T4 PNK Buffer：70 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，5 mM DTT(pH 7.6 @ 25°C)，37℃溫育。
濃度：10U/μl
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復凍融
特點與適用范圍
? DNA或RNA 5′末端的磷酸化，以便進行連接反應
? DNA或RNA的末端標記，用作探針和進行DNA測序
? T4多聚核苷酸激酶（缺失3′磷酸酶活性）將3′ 已經磷酸化的單核苷酸5′磷酸化，制備pNp底物，用于添加到DNA或RNA的 3′端
? 用T4多聚核苷酸激酶（缺失3′磷酸酶活性）對3′端有磷酸基團的寡核苷酸的5′端進行標記
產品包裝規格及組成
Component | AE1002A | AE1002B |
T4 PNK(3′磷酸酶活性缺失) | 200U | 1000U |
10× T4 Polynucleotide Kinase Buffer | 0.3ml | 1.0ml |
質量控制
經過嚴格的質控檢測，確保該產品具有最高的活性和純度。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，50 mM KCl，1 mM DTT， 0.1 mM EDTA，50% Glycerol，0.1 μM ATP ，pH 7.4 @ 25°C
相關產品
AE1301: T4 DNA ligase
應用實例
1. 引物或PCR產物磷酸化
1）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積活濃度 |
10× Buffer | 5 |
ATP（50mM） | 0.5-1 |
待磷酸化引物（100uM）或PCR產物 （100ng-2ug/ul） | 20 |
T4 Polynucleotide Kinase (10U/μl) | 1 |
H2O | Xul |
總體積 | 50 |
2）37℃×30-120min反應，
3）65℃×20min失活
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 熱失活：65°C加熱20分鐘。
l 達到最佳酶活力，需要新鮮緩沖液（在舊緩沖液中，由于氧化造成的DTT含量減少會降低酶活力）。
l 放射性標記反應：50 μl反應體系中，用 1×T4多聚核苷酸激酶反應緩沖液、50 pmol的 γ-[32P] ATP和20單位的酶37℃溫育30分鐘可催化1-50 pmol的5′末端磷酸化。[33P] ATP 可代替 [32P] ATP作標記反應。
l CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及dTTP均可替代ATP作為磷酸供體。
l 要提高平齊末端或5′凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先將DNA溶液于70℃加熱5分鐘，然后冰上冷卻，并加入5%（w/v）的PEG-8,000。
l T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能發揮活性，但是為了適用于高活力的放射性標記反應，在隨酶提供的反應緩沖液中不含ATP。
l 一般來說，進行激酶反應之后是連接反應。在這種情況下，T4多聚核苷酸激酶反應在連接酶反應緩沖液中37℃溫育30分鐘即可。反應后的產物可直接進行連接，無需改變緩沖液和進行熱失活。如果連接時需要保持其它DNA片段的去磷酸化狀態，則需要在連接反應前熱失活T4多聚核苷酸激酶。
