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產(chǎn)品說明
外切核酸酶III作用于雙鏈 DNA，從 3′ OH 末端方向逐步切去單核苷酸。每次酶與底物結(jié)合催化，只有幾個核苷酸被除掉，從而在 DNA 分子群內(nèi)產(chǎn)生漸進(jìn)式3’端缺失。
盡管可以作用于雙鏈 DNA 的切刻產(chǎn)生單鏈缺口，但該酶最適底物是平齊末端或 3′ 凹陷末端 DNA。由于對單鏈 DNA 無活性，因此該酶無法切割 3′ 突出末端。3′ →5′ 外切酶活性對底物的切割程度隨 3′ 突出末端的長度而變化，四堿基或更長的突出末端完全不能被切割。
核酸外切酶 III 的活性部分依賴DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，并根據(jù)序列的不同而有差異（C＞A=T＞G）。溫度、鹽濃度和酶與 DNA的比例對酶活性影響很大，應(yīng)根據(jù)不同的反應(yīng)調(diào)整反應(yīng)條件。
核酸外切酶 III 也有 RNase H、3′ -磷酸酶、脫嘌呤/嘧啶（AP）位點特異性核酸內(nèi)切酶活性。
本公司Exonuclease III是重組表達(dá)，并經(jīng)多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1活性單位指在37℃條件下， 30 min內(nèi)催化生成1nmol酸可溶性總核苷酸所需的酶量。
活性測定條件
1×AM BufferA: 10 mM Bis-Tris，10 mM MgCl2，1 mM DTT（pH 7.0）
濃度：100U/μl
保存條件：-20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融
特點與適用范圍
? 3′ →5′ 外切酶活性
? 雙鏈DNA的非定向巢式缺失
? RPA擴(kuò)增中熒光探針的降解，釋放熒光信號
? 制備用于雙脫氧測序的單鏈模板
產(chǎn)品包裝規(guī)格及組成
Component | AE2102A | AE2102B |
Exonuclease III | 2500U | 12500U |
10×AM Buffer A | 0.2ml | 1.0ml |
質(zhì)量控制
經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控檢測，確保該產(chǎn)品具有最高的活性和純度。
酶貯存緩沖液
200 mM KCl，5 mM KPO4，5 mM β-ME，0.05 mM EDTA，200 μg/ml BSA，50% Glycerol (pH 6.5@25℃)。
相關(guān)產(chǎn)品
AE2101: lambda exonuclease
應(yīng)用實例
1. 酶切反應(yīng)
1）按下表配制反應(yīng)體系
反應(yīng)組分 | 體積/ul |
10× Buffer | 5 |
平末端或5’突出端（3’ 凹陷末端）DNA | 2-5ug |
Exonuclease III (100U/μl) | 1 |
H2O | variable |
總體積 | 50 |
2）37°C反應(yīng)30min；
3）75°C加熱10min，使酶失活
4）電泳檢測雙鏈DNA水解結(jié)果。
2. RPA熒光釋放反應(yīng)
1）按下表配制反應(yīng)體系
反應(yīng)組分 | 體積/ul |
10 × RPA Buffer | 5 |
RPA Mix | Xul |
5 | |
RPA引物R（10uM） | 5 |
RPA熒光探針（10uM） | 1 |
Exonuclease III (100U/μl) | 1 |
H2O | variable |
總體積 | 50 |
2）在熒光檢測儀（qPCR儀）中37°C反應(yīng)15-60min；
3）觀測熒光曲線。
警告: 本產(chǎn)品僅限科研實驗使用，臨床應(yīng)用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫(yī)療臨床診斷。
注意事項
l 核酸外切酶 III 不能切割硫代磷酸酯鍵。因此，也可以通過引入一個 α-硫代磷酸核苷酸將 DNA 分子的一端保護(hù)起來，以進(jìn)行單向切割。
l 這種特性可以用于對一端為鈍化末端（3′ 突出端），另一端是敏感末端（平端或 5′ 突出端）的線性 DNA 分子進(jìn)行單方向切割。
l 在如下Buffer中的活性為：AM Buffer 1：100%，AM Buffer 2：75%，AM Buffer 3：25%，AM Buffer 4：75%，AM Buffer 4.1：100%
