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產品說明
熱穩定核酸內切酶 IV 來源于嗜熱細菌，為脫嘌呤/脫嘧啶（AP）位點特異性的核酸內切酶。該酶切割 AP 位點 5′ 端的第一個磷酸二酯鍵，產生 3′ 羥基和 5′ 脫氧核糖磷酸末端。除天然的AP位點外，各種人工合成的Spacer分子也能夠被內切核酸酶IV有效切割，包括THF、Spacer C3、Spacer C12、Spacer 9，Spacer 18等。該酶也具有 3′二酯酶活性，能從 DNA 的 3′末端釋放磷酸甘油醛（phosphoglycoaldehyde）、α,β-不飽和醛（α,β-unsaturated aldehydes）、3’-磷酸、其它3' blocking groups。該酶還能夠作用于 DNA 分子上的幾種氧化性損傷，水解氧化損傷堿基的5’端第一個磷酸二酯鍵。 另外，該酶還具有3′-5′的外切酶活性。酶活性受到金屬離子、DTT、EDTA等的影響，優先作用于3′凹末端的雙鏈DNA。
本公司熱穩定核酸內切酶 IV是在大腸桿菌中重組表達，并親和純化的重組蛋白。
活性定義
1 單位指在65℃ 條件下，1小時能切割 1 pmol 含一個 AP 位點的 34 bp 熒光標記的寡核苷酸雙鏈所需要的酶量。
AP 位點的制備方法如下：37℃條件下，用1U尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）處理 10 pmol 含一個尿嘧啶堿基的34 bp寡核苷酸雙鏈2分鐘。
活性測定：
1× AM Buffer E：10 mM KCl，20 mM Tris-HCl，10 mM (NH4)2SO4，2 mM MgSO4，0.1% Trition X-100（pH 8.8 @ 25℃），65℃ 溫育。
濃度：10U/μl
保存條件：-20℃保存
特點
? 具有很好的熱穩定性，可以在65-75℃反應；
? 在多種反應體系中均有活性。
適用范圍
? 與高溫UDG一起改善高忠實性DNA聚合酶PCR擴增性能
? 單細胞凝膠電泳（彗星試驗）；
? 切斷合成的寡核苷酸中各種Spacer，例如，Spacer C3，Spacer C18，Spacer 9等；
? 修復損傷的DNA。
產品包裝規格及組成
Component | AE1142A | AE1142B |
Tth內切核酸酶IV | 500U | 2.5kU |
10×AM BufferE | 0.2ml | 1ml |
質量控制
相關測試表明無外源內切、外切脫氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% Glycerol， pH 8.0 @ 25°C。
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AE1103: Thermostable UDG
應用舉例
1、改善PCR擴增效果
1. 按如下表格配制PCR反應液
PCR 組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Pfu酶Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | 1-5 | / |
Pfu DNA聚合酶（2U/μl） | 0.5 | 1U |
耐熱UDG（2U/μl） | 1.0 | 2U |
Tth內切核酸酶IV（10U/μl） | 1.0 | 10U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
2. PCR反應。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 該酶的最佳反應溫度為65-70°C。該酶與PCR反應條件兼容。
l 彗星試驗的推薦稀釋度：1:104-1:105。
l Endo IV最佳緩沖液為1× AM Buffer C。該酶在AM Buffer B中的活性為100%，在AM BufferD2緩沖液中的活性為25%。不建議在AM BufferA中使用Endo IV。
l 本酶為高溫酶，不能直接熱失活。若需失活該酶可以進行酚氯仿抽提，或加入終濃度50mM EDTA并在95℃ 加熱 20 分鐘。
l 本酶有高濃度包裝（200U/ul），在用于改善PCR擴增效果時建議使用高濃度包裝，且每個PCR反應加入量為20-200U。
l 用于改善PCR擴增效果時，其原理如下：高溫UDG切除dU堿基產生無堿基AP位點，高溫內切核酸酶IV斷裂AP位點，并由DNA聚合酶進行延伸，修復成全長DNA片段。
l 本酶活性隨溫度升高而增強，具體應用建議在不同溫度下摸索酶具體用量。
l 酶稀釋緩沖液: 100 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol.
