咨詢熱線：
400-660-9586
產品說明
TGIRT-III RTnase具有依賴于DNA/RNA雜交鏈的反轉錄酶活性，能快速合成cDNA，該酶具有強的鏈轉換活性（Switch）。因此該酶可用于tRNA、ncRNA、miRNA等核酸分子的同步逆轉錄和加接頭（TGIRT template-switching reaction，用于TGIRT-Seq）。TGIRT-III RTnase具有極強的延伸性能，因此更易獲得全長的cDNA。此外，該酶的強switch活性，使得可以利用RNA的5’端帽結構進行SMART建庫（SAMRT-Seq）。反應溫度為37-60°C，最佳反應溫度為50°C。
本公司TGIRT-III Reverse Transcriptase是重組表達，并經多步純化制備的重組蛋白。
活性定義
1活性單位指在50℃下， 1×TGIRT-III Reverse Transcriptase反應緩沖體系下，利用poly(rA)/oligo(dT)42作為底物，10 min內將10nmole dNTP摻入酸不溶性物質所需的酶量。
活性測定條件
1×TGIRT Buffer1：20 mM Tris-HCl（pH7.5），0.45 M NaCl，5 mM MgCl2。
1×TGIRT Buffer2：20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT。
室溫孵育30min后，加入2.5 μl的10 mM dNTP后，于50°C下反應30min。
失活
反應結束后，向反應體系中加入1μl的5N NaOH（終濃度0.25N），并置于95°C下加熱3min，失活該酶。失活后加入1ul的5N HCl中和NaOH。
濃度：10 pmole/μl
保存條件：長期儲存置于-20°C以下，可保存2年。
特點
? 比逆轉錄病毒逆轉錄酶更高的熱穩定性，持續性和保真度，能夠以高度結構化或修飾的RNA為模板，合成全長的端到端cDNA。
? 新的端對端模板轉換活性，其能夠在逆轉錄過程中連接RNA-seq或PCR接頭，并且不再需要單獨的RNA 3'-接頭連接步驟。
? 不需要RNA連接酶，對模板量要求低，簡化RNA-seq文庫構建步驟，且更高效。
適用范圍
? 確定RNA高級結構
? 長cDNA的合成
? 全基因組或靶向RNA結構分析
? 鏈特異性轉錄組分析
? 全細胞或無細胞轉錄組測序
? 非編碼RNA轉錄組測序
? RIP-seq，HITS-CLIP，irCLIP and CRAC
? 通過高通量測序鑒定RNA堿基修飾
產品包裝規格及組成
Component | AE0442A | AE0442B | AE0442C | AE0442D |
TGIRT-III RTnase（10pmol/ul） | 100ul | 500ul | 500ul×4 | 500ul×10 |
5×TGIRT Buffer 1 | 0.5ml | 1.0ml×2 | 5.0ml×2 | 5.0ml×5 |
5×TGIRT Buffer 2 | 0.5ml | 1.0ml×2 | 5.0ml×2 | 5.0ml×5 |
100mM DTT | 0.25ml | 1.2ml | 1.0ml×4 | 1.0ml×10 |
質量控制
經過嚴格的質控檢測，確保該產品具有最高的活性和純度。
反應Buffer
5×TGIRT Buffer1: 100mM Tris-HCl, pH7.5, 2.25M NaCl, 25mM MgCl2。
5×TGIRT Buffer2: 100mM Tris-HCl, pH7.5, 50mM NaCl, 50mM MgCl2, 5mM DTT。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, and 50% glycerol。
注意事項
l 本酶為熱穩定性酶，簡單高溫加熱不能完全失活酶。
l 若需要反應結束后失活酶，應加入終止反應液，然后再加熱失活酶，需考慮終止液對后續實驗的影響。
l 終止液包括終濃度：0.2M NaOH、100mM EDTA、1%SDS等，若進行后續實驗，建議終止液使用終濃度0.25M NaOH加熱失活，并加入等量HCl中和NaOH。
使用實例：
1）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積或濃度 |
5×Buffer | 4ul |
100mM DTT | 2ul |
底物：退火的DNA引物/RNA模板* | Xul |
酶(10p/μl) | 1-2ul |
H2O | Yul |
總體積 | 20ul |
2）室溫孵育 30min
3）加入 2.5 μl 的 10mM dNTP 后，于 50°C條件下反應 10-60min（通常 15min）
4）反應結束后，向反應體系中加入 1μl 的 5N NaOH， 95°C加熱 3min，失活酶。失活后加入 5N HCl 中和堿。
5）尿素變性PAGE電泳或瓊脂糖電泳檢測酶切產物，或按實驗目的進行后續操作。
* RNA加入量1-100ng
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
