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產品說明
SplintR 連接酶也稱為PBCV-1 DNA連接酶或Chorella病毒DNA連接酶，在ATP作為輔助因子條件下，在模板RNA鏈存在下，高效連接與RNA鏈互補的相鄰的DNA的5′磷酸末端和3′羥基末端。被連接的可以是兩條DNA單鏈；也可以是一條DNA的5’端與3’端與RNA模板以環狀形式配對，連接成一個環狀的DNA單鏈。因此非常適合基于鎖式探針(Padlock probe)或上下游雙探針的microRNA檢測。鎖式探針是一種較長的單鏈DNA寡核苷酸片段，兩個末端和靶標序列毗鄰互補，探針中間的一段序列不與靶標序列配對，可以作為通用引物的結合位點。本酶對于平末端、粘性末端的連接、以及雙鏈DNA、雙鏈RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口都可以連接。SplintR 連接酶的這種活性可以用于miRNAs等微小RNA和mRNA 的檢測與單核苷酸多態性SNP分析。在二代測序和分子診斷等眾多領域中，SplintR是富集目的基因的理想選擇。SplintR連接酶是RNA檢測的最佳用酶，其對RNA介導固定的DNA底物親和性強（米氏常數 Km = 1 nM），能夠在復雜的混合物中檢測到亞納摩爾級的特定RNA。
SplintR 連接酶在廣泛條件下，例如10 μM - 1 mMATP，pH 6.5–9.0，均有活性。其中最優反應條件為高于5 mM Mg2+，pH 7.5 - 8.0。37°C反應，補充5 mM Mn2+可以提高反應活性。高于100 mM一價陽離子抑制酶活性。相比dA/U堿基對, 5’端dC/G與dG/C 堿基對對連接反應具有部分抑制作用，特別是相鄰的堿基對也是C/G的情況。
本公司SplintR Ligase是重組表達，并經多步純化制備的重組酶。
活性定義
1單位指在溫度為25℃，1× SplintR Ligase 反應緩沖體系的條件下，15min內連接50%的2pmol DNA鏈（與RNA雜交配對形成的帶缺口的DNA/RNA底物）所需的酶量。
活性測定條件
50 mM Tris-HCl ，1 mM ATP，10 mM MgCl2，10 mM DTT(pH 7.5 @ 25℃)，25℃ 溫育。
濃度：25U/μl
保存條件：-20℃保存
特點與適用范圍
? 基于DNA探針連接進行RNA檢測
? SNP或剪接變異檢測
? 基于鎖式探針(Padlock probe)的microRNA檢測
? 互補RNA序列配對的單鏈DNA連接反應
? RASL-seq（RNA-mediated oligonucleotide annealing, selection, and ligation with next-generation sequencing）
? 熱失活：65℃ 加熱20min。
產品包裝規格及組成
Component | AE1359A | AE1359B |
SplintR Ligase | 2000U | 10kU |
10× SplintR Ligase Buffer | 0.3ml | 1.5ml |
質量控制
相關測試表明無外源內切、外切脫氧核糖核酸酶、RNase污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA。
酶貯存緩沖液
10 mM Tris-HCl，300 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mM EDTA ，50% Glycerol，pH 7.4 @ 25°C。
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AE1351: T4 RNA Ligase
應用實例
1. RNA模板指導的DNA連接反應
建議反應體系中底物濃度在50 nM~2μM之間，體系中酶的濃度低于1 μM（本SplintR酶約為10μM）。在連接反應中，酶的濃度可設為底物濃度的2~3倍。
1）將等摩爾濃度的RNA模板和互補配對的5’磷酸化 DNA混合均勻，75°C 2min后緩慢降溫至室溫。
2）按下表配制反應體系
反應組分 | 體積/ul |
10× Buffer | 2 |
退火后RNA/DNA底物 | 100ng-1μg |
SplintR Ligase (25U/μl) | 1 |
H2O | Variable |
總體積 | 20 |
3）25°C連接15-60min；
4）65°C加熱20min，使酶失活；
5）根據實驗目的，進行PAGE電泳檢測連接產物，或進行phi29 DNA聚合酶催化的滾環復制。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
注意事項
l 本產品需要輔助因子ATP參與反應
l 本酶活性受單價陽離子抑制，因本酶保存在含300mM NaCl的儲存液中，建議使用時酶的加入量不要超過反應體積的5%；或將酶稀釋5-10倍使反應體系中常見一價陽離子(NaCl、KCl)濃度降低至50 mm以下。
l 反應溫度設定在16–37°C，初次嘗試建議25°C
l SplintR Ligase濃度為10.5 μM，建議反應體系連接酶濃度為100 nM - 1 μM，或者為底物可連接末端的2倍。 若需要稀釋酶，建議使用本公司稀釋緩沖液A（DB001）。
l 若來連接效率不理想，建議延長連接反應時間，盡量避免增加酶濃度超過1 μM.
l 如果某一特定底物（例如缺口附近具有多個連續G:C堿基對）的連接效率低，可以降低ATP濃度，通常會顯著提高連接效率。推薦本公司Buffer為：1× T4 RNA Ligase Reaction Buffer (目錄號AE1351) ，添加終濃度10 μM的ATP。
l RNA模板與待連接的DNA探針之間的配對堿基數總數不低于20bp，可以滿足正常的連接反應。缺口兩側的配對區不一定要求相等，單側配對區最低為4-6個堿基對也可以發生有效連接，但與具體堿基序列有一定相關性。
l 添加SSB蛋白（例如本公司SSB蛋白，目錄號AE1902，AE1903，AE1904，AE1905，AE1906）可以提高連接效率，并降低非模板指導的DNA探針與RNA的連接。
l 提高連接反應溫度可以提高連接忠實性
