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產品說明
本酶為熱啟動Pfu DNA聚合酶，來源于大腸桿菌重組表達的Pyrococcus furiosus DNA聚合酶，分子量為90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的18倍左右。本酶經特殊改造，具有超強擴增能力和延伸速度，擴增片段的長度可達5-6 kb，延伸速度為1 kb/ min（72℃）。該酶具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。擴增產物為平末端，不適合TA克隆。
活性定義
以大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在72℃、30 min內，將10 nmol脫氧核糖核苷酸摻入到酸不溶物中所需的酶量，定義為一個活性單位（U）。
濃度：2.5U/μl
保存條件：-20℃保存
特點
? 本酶為熱啟動聚合酶，可提高擴增的特異性，減少非特異性擴增和引物二聚體；
? 本酶經特殊改造，相比傳統Pfu DNA聚合酶，具有加強的擴增能力和延伸速度，可在1kb/ min延伸條件下，有效擴增5-6kb的DNA片段；
? 熱穩定性好：98℃下半衰期超過60 min；
? 保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的10倍；
? 不耐受dUTP、dITP；
? PCR產物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。
適用范圍
? 高保真性PCR擴增
? 制備基因克隆或蛋白表達用的PCR產物
? 平末端PCR克隆(去除3’突出端)
? 位點特異性突變
產品包裝規格及組成
Component | AE0205A/ AE0206A* | AE0205B/ AE0206B* | AE0205C/ AE0206C* | AE0205D/ AE0206D* |
HS Pfu DNA polymerase | 100U | 500U×5 | 500U×4 | 1000U×5 |
10×Pfu Buffer | 0.5 ml×1 | 0.5 ml×5 | 1.0 ml×10 | 1.0 ml×25 |
2 mM dNTPs | -/0.5 ml×1 | -/0.5 ml×5 | -/1.0 ml×10 | -/1.0 ml×25 |
*附帶2mM dNTP混合物。
質量控制
相關測試表明無外源內切酶或外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染。PCR方法檢測無宿主殘余DNA，能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。
室溫放置一周，擴增活性無明顯改變；但強烈建議不要在室溫下長期放置，用畢放回-20度。
酶貯存緩沖液
20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% Nonidet P40, 0.1% Tween 20, and 50% glycerol.
應用舉例
注：以下反應舉例為50 μl標準PCR體系， 僅供參考。實際PCR條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
組份 | 體積/μl | 終濃度 |
10×Pfu Buffer | 5 | 1× |
dNTPs（2.0 mM） | 5 | 0.2 mM |
引物F（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
引物R（10 μM） | 1.5 | 0.3 μM |
Template | Varable* | / |
HS Pfu（2.5U/μl） | 1.0 | 2.5U |
ddH2O | Varable | / |
總體積 | 50 | / |
*DNA template可參照如下標準（50 μl PCR體系）：
l 人類基因組DNA | 0.1 μg-1 μg |
l λDNA | 0.5 ng-5 ng |
l 質粒DNA | 0.01 ng-1 ng |
l 大腸桿菌DNA | 10 ng-100 ng |
PCR反應條件
95℃ | 5min | |
95℃ |
| |
55~72℃ | 20 sec | 30 Cycles |
72℃ | 1kb/min | |
72℃ | 5 min |
注意事項
l 本酶為熱啟動聚合酶，需95度加熱5分鐘或98度加熱2分鐘而激活；因此有利于提高擴增的特異性，減少非特異性擴增和引物二聚體，得到良好的PCR結果。
l Pfu DNA聚合酶具有很強的3’外切核酸酶活性，因此在PCR產物3’為平末端，不適合TA克隆。要進行TA克隆需用Taq DNA聚合酶對PCR產物進行加A處理。
l Pfu DNA聚合酶為高保真酶，忠實性是Taq DNA聚合酶的18倍。
l 建議在冰上配置PCR 反應液后，再放入PCR儀中進行擴增。這有利于提高擴增的特異性，減少非特異性擴增，得到良好的PCR結果。
l 如進行PCR擴增后，除目的條帶外，還伴隨其他雜帶，建議適當減少體系中的酶用量，以增加PCR擴增反應的特異性。
l 本公司Buffer經大量PCR反應實例優化而成，然而對某些PCR反應存在一個最優的鎂離子濃度。若需要優化鎂離子濃度，請購買本公司不含鎂離子的buffer和MgCl2/MgSO4。
l 因該酶與含有尿嘧啶和次黃嘌呤的DNA模板結合后會抑制DNA聚合反應，故dUTP、dITP和含有這些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR擴增。
警告: 本產品僅限科研實驗使用，臨床應用安全性和有效性未鑒定，不可用于醫療臨床診斷。
