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Component | AQ0111A | AQ0111B | AQ0111C | AQ0111D |
HSTaq UDG qPCR 2 × SuperMix（SYBR Green） | 1ml | 1ml×5 | 5ml×4 | 50ml |
50×Low ROX | 40μl | 200μl | 800μl | 1000μl×2 |
50×High ROX | 40μl | 200μl | 800μl | 1000μl×2 |
Nuclease-free Water | 1ml | 5ml | 20ml | 50ml |
產品說明：
本產品HSTaq UDG qPCR 2×SuperMix（SYBR Green）是使用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法進行qPCR反應的專用預混液。可用于雙鏈DNA和cDNA單鏈分子的定量分析，樣本類型包括基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA等。本產品包含熱啟動型 Taq DNA聚合酶、UDG、dNTPs、dUTP、SYBR Green和優化的反應緩沖液，濃度為2×。qPCR 反應時，只需加入模板、引物和水，使2×SuperMix溶液的濃度為1×即可進行反應。核心組分熱啟動Taq DNA聚合酶用抗體法修飾的改造型Taq酶，具有特異性強、檢測靈敏度高、擴增產量高等諸多優點。Buffer專門針對qPCR進行了優化，非常適合于進行高特異性、高靈敏度的qPCR檢測。UDG和dUTP的加入可以防止樣品的氣溶膠交叉污染。某些型號的qPCR儀需要ROX 參比染料。
特點：
? 減少qPCR操作時間。
? 避免因多步操作帶來的污染。
? DNA片段的定量 (≤4 kb)。
? 熱啟動Taq酶，非特異性擴增導致的假陽性信號低。
? 擴增效率高、穩定性好。
適用范圍：
SYBR green 染料型qPCR檢測。
4度保存1個月；-20℃保存1年。
以下反應舉例為 50 μl 標準 qPCR 體系， 僅供參考。實際 qPCR 條件應根據模板、引物、目的片段大小加以優化，確定最佳反應條件。
1.在qPCR管中配制如下混合液
Component | Volume | Final Concentration |
qPCR HSTaq UDG 2×SuperMix（SYBR Green） | 25μl | 1× |
Forward Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Reverse Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
DNA/cDNA Template | Variable | as required |
dd H2O | Variable | - |
Total volume | 50μl | - |
反應體系中各成分的量可根據以下原則自行調整：
l 有些q-PCR儀需要加入參比染料ROX進行校正，參比染料使用請咨詢儀器生產商。
l 一般來說反應體系中引物終濃度為0.2 μM即可得到較好的擴增效果。當反應性能比較差時，可以在終濃度0.1 - 1.0 μM范圍內調整引物濃度。
l qPCR靈敏度極高，加入模板量的準確程度對最終定量結果會有很大的影響。對于高濃度模板，推薦將模板稀釋10-100倍后加入反應體系中，這樣可以有效提高實驗的準確性。
2.按下列條件進行qPCR反應
（1）常規擴增條件 （2）退火延伸一步法擴增條件
95℃ | 1 min | 預變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環擴增 30-40 Cycles |
50~60℃ | 15 sec | |
72℃ | 15 sec | |
72℃ | 1 min |
95℃ | 1 min | 預變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環擴增 30-40 Cycles |
60-68℃ | 30 sec | |
72℃ | 1min |
注意事項
l 本預變性條件適合絕大多數擴增反應，如模板結構復雜，可將預變性時間延長至3 min，以提高預變性效果。
l 常規變性時間選擇10 sec；快速變性時間最短可選5 sec。
l 常規擴增條件的退火溫度可以根據引物的Tm值進行調整，當Tm較高時可以提高退火溫度，增加擴增條帶的特異性。
l （1）常規擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間72度15 sec，200 bp以內片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法擴增條件下，200-300 bp片段延伸時間60度30 sec；200 bp以內片段延伸時間60度20 sec。
l 退火延伸一步法擴增條件下的引物Tm值需要高于延伸溫度3-5度。
l 儀器類型不同，融解曲線采集程序不盡相同，使用儀器默認融解曲線采集程序即可。
注意事項：
l 不適用于RNA的定量分析，RNA定量請使用本公司的SYBR Green型RT-qPCR 2×SuperMix（AQ0401系列）。
l 本品在4度避光保存3個月內穩定，盡量避免反復凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。
l 使用前請上下顛倒以混勻Master Mix，短暫低速離心后即可使用。請勿vortex避免酶失活，影響定量結果。
l 加樣過程中輕柔吹打，如果操作不慎導致SuperMix起泡，需離心方可使用。
l 本品含有熒光染料SYBR Green I，需避光保存，配制反應體系時應盡量避免強光照射。
l 為了防止環境DNA的污染，反應體系配制時請于超凈工作臺內進行，配制過程中請使用滅菌槍頭、反應管
