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Component | AQ0112A | AQ0112B | AQ0112C | AQ0112D |
HSTaq UDG qPCR 2 × SuperMix（Taqman） | 1ml | 1ml×5 | 5ml×4 | 50ml |
Nuclease-free Water | 1ml | 5ml | 20ml | 50ml |
產(chǎn)品說(shuō)明：
HSTaq UDG qPCR 2×SuperMix（Taqman）用于DNA分子的定量分析。本產(chǎn)品包含熱啟動(dòng)型 Taq DNA聚合酶、UDG、dNTPs、dUTP和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。可用于雙鏈DNA和cDNA單鏈分子的定量分析，樣本類(lèi)型包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA等。qPCR 反應(yīng)時(shí)，只需加入模板、引物、Taqman 探針和水，使2×SuperMix溶液的濃度為1×即可進(jìn)行反應(yīng)。核心組分熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶用抗體法修飾的改造型Taq酶，具有擴(kuò)增產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。Buffer專(zhuān)門(mén)針對(duì)Taqman探針?lè)╭PCR進(jìn)行了優(yōu)化，非常適合于進(jìn)行高特異性、高靈敏度的qPCR檢測(cè)。Taqman探針?lè)軌蛳锒垠w和非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性。UDG和dUTP的加入可以防止樣品的氣溶膠交叉污染。
特點(diǎn)：
? UDG和dUTP的加入可以防止樣品的氣溶膠交叉污染。
? 減少qPCR操作時(shí)間。
? 避免因多步操作帶來(lái)的污染。
? DNA片段的定量 (≤4 kb)。
? 熱啟動(dòng)Taq酶，非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致的假陽(yáng)性信號(hào)低，擴(kuò)增效率高、穩(wěn)定性好。
適用范圍：
Taqman型qPCR擴(kuò)增與DNA定量檢測(cè)。
4 度保存 1 個(gè)月；-20℃保存 1 年。
以下反應(yīng)舉例為 50 μl 標(biāo)準(zhǔn) qPCR 體系， 僅供參考。實(shí)際 qPCR 條件應(yīng)根據(jù)模板、引物、目的片段大小加以優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。
1.在qPCR管中配制如下混合液
Component | Volume | Final Concentration |
HSTaq UDG qPCR 2 × SuperMix（Taqman） | 25μl | 1× |
Forward Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Reverse Primer（10μM） | 1.5μl | 0.3μM |
Taqman probe（10μM） | 0.5-1.0μl | 0.1-0.2μM |
Template | Variable | as required |
dd H2O | Variable | - |
Total volume | 50μl | - |
反應(yīng)體系中各成分的量可根據(jù)以下原則自行調(diào)整：
l 一般來(lái)說(shuō)反應(yīng)體系中引物終濃度為0.2μM即可得到較好的擴(kuò)增效果。當(dāng)反應(yīng)性能比較差時(shí)，可以在終濃度0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
l Taqman探針的濃度一般在0.05-0.2μM，可能需根據(jù)擴(kuò)增基因和探針的不同而進(jìn)行濃度優(yōu)化。
l qPCR靈敏度極高，加入模板量的準(zhǔn)確程度對(duì)最終定量結(jié)果會(huì)有很大的影響。對(duì)于高濃度模板，推薦將模板稀釋10-100倍后加入反應(yīng)體系中，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
2.按下列條件進(jìn)行qPCR反應(yīng)
（1）常規(guī)擴(kuò)增條件 （2）退火延伸一步法擴(kuò)增條件
95℃ | 1 min | 預(yù)變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環(huán)擴(kuò)增 30-40 Cycles |
50~60℃ | 15 sec | |
68℃ | 20-30 sec | |
72℃ | 1 min |
95℃ | 1 min | 預(yù)變性 |
95℃ | 5-10 sec | 循環(huán)擴(kuò)增 30-40 Cycles |
60-68℃ | 30 sec | |
72℃ | 1min |
注意事項(xiàng)
l 本預(yù)變性條件適合絕大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，如模板結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可將預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)至3 min，以提高預(yù)變性效果。
l 常規(guī)變性時(shí)間選擇10 sec；快速變性時(shí)間最短可選5 sec。
l 常規(guī)擴(kuò)增條件的退火溫度可以根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整，當(dāng)Tm較高時(shí)可以提高退火溫度，增加擴(kuò)增條帶的特異性。
l （1）常規(guī)擴(kuò)增條件下，200-300 bp片段延伸時(shí)間68-72度15 sec，200 bp以內(nèi)片段72度10 sec；（2）退火延伸一步法擴(kuò)增條件下，200-300 bp片段延伸時(shí)間60度30 sec；200 bp以內(nèi)片段延伸時(shí)間60度20 sec。
l 為了確保Taqman探針被有效切割，引物和探針的Tm值需要高于延伸溫度2-3度。
l 儀器類(lèi)型不同，融解曲線采集程序不盡相同，使用儀器默認(rèn)融解曲線采集程序或咨詢一起生產(chǎn)商即可。
注意事項(xiàng)：
l 不適用于RNA的定量分析，RNA定量請(qǐng)使用本公司的Taqman探針型RT-qPCR 2×SuperMix（AQ0402系列）。
l 本品在4度避光保存3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定，盡量避免反復(fù)凍融，以免造成酶活下降。如每次使用量較少，推薦小份分裝使用。
l 使用前請(qǐng)上下顛倒以混勻Master Mix，短暫低速離心后即可使用。請(qǐng)勿vortex避免酶失活，影響定量結(jié)果。
l 加樣過(guò)程中輕柔吹打，如果操作不慎導(dǎo)致SuperMix起泡，需離心方可使用。
l 本品使用時(shí)額外加入的Taqman熒光探針需避光，因此配制反應(yīng)體系時(shí)應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射。
l 為了防止環(huán)境DNA的污染，反應(yīng)體系配制時(shí)請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，配制過(guò)程中請(qǐng)使用滅菌槍頭、反應(yīng)管
